© sciencedirect.com
Этому образцу, описанному Джорджем Пойнаром (George Poinar) и Алексом И. Брауном (Alex E. Brown), около 100 миллионов лет. Достоверно извлечь ДНК из таких древних включений пока не удавалось.
Недавние попытки выделить и секвенировать ДНК из образцов насекомых, сохранившихся в полуокаменевшей древесной смоле, известной как копал и считающейся предшественницей янтаря, не увенчались успехом. Исследовались два образца возрастом, соответственно, менее шестидесяти лет и чуть более десяти тысяч лет. В обоих образцах были заключены экземпляры безжальных ос, и обе попытки прочесть их ДНК дали более чем скромный результат. Из чего учёные сделали вывод, что древесная смола — плохая среда для консервации генома и что, раз ДНК оказалась, практически, нечитаемой в таких относительно молодых образцах, то ожидать, что можно можно будет извлечь и прочитать ДНК из образцов, заключённых в многомиллионолетнем янтаре, тем более не стоит. Новое исследование однако доказывает, что смола может сохранять ДНК, по крайней мере, несколько лет.
Во вступительной части статьи по результатам нового исследования авторы отмечают, что прежние попытки извлечь ДНК из организмов, заключённых в янтаре, особенно когда речь об образцах, которым многие миллионы лет, либо потерпели неудачу, либо подверглись критике — как объявившие результаты современного загрязнения якобы обнаруженной древней ДНК. Недостатки ранних работ подтверждались отсутствием воспроизводимости. Всё это, а также упомянутые выше недавние отрицательные результаты с образцами полуокаменевшего копала, вроде бы свидетельствует в пользу того, что нет смысла пытаться читать геном организмов, попавших в смолу. Но учёные не оставляют попыток.
Авторы нового исследования решили не замахиваться сразу на древнюю ДНК, а начать со свежих образцов, пролежавших в смолистых материалах несколько лет. Исследователи собрали маленьких жуков семейства Curculionidae (долгоносики), попавших в смолу деревьев вида Hymenaea verrucosa на Мадагаскаре. Смолу Hymenaea verrucosa выбрали, потому что деревья этого же рода были источниками обильных залежей миоценового янтаря в Мексике, Доминиканской республике, Перу и Эфиопии. Возраст выбранных образцов составил 2 года и 6 лет.
Собранные для исследования образцы смолы с заключёнными в них жуками.
Палеонтологов столь недавние включения в смолистые материалы не интересуют, так как содержат, как правило, ныне живущие виды, доступные для изучения и без подобных ухищрений. Однако, во-первых, отработку метода надо с чего-то начинать. Во-вторых — в смоле могут сохраняться экземпляры недавно вымерших или вымирающих видов, и извлечение их генетического материала из таких образцов может содействовать не только «чистой» науке, но и делу сбережения и восстановления исчезающих популяций. Целью исследования было — приступить к изучению потенциальных пределов сохранения ДНК в смолах и разработать стандартизированный протокол его извлечения из последних.
Образцы аккуратно разрезали на мельчайшие кубики, оставив вокруг каждого включённого насекомого минимум смолы. Поверхность кубиков стерилизовали хлороводородом, затем их промыли в стерильной воде, измельчили микропестиком в пробирке и приступили к экстракции ДНК. Для уверенности в отсутствии загрязнений, эксперименты проводились под куполом, чтобы исключить контакт с продуктами других опытов, проводящихся в той же лаборатории, а все инструменты и поверхности регулярно стерилизовались.
В итоге исследование показало, что, хотя смола и не лучшая среда для консервации молекулы ДНК, в рассматриваемых образцах она всё же сохранилась. Извлечь её удалось далеко не сразу, и концентрация ДНК, извлечённой из смоляных образцов, была значительно ниже, чем при извлечении для контроля из «свежих» жуков. Самая низкая концентрация была показана в смоляных образцах, которые перед извлечением генетического материала были растворены в хлороформе (метод, практиковавшийся ранее для «освобождения» древних организмов из янтарного плена). Первоначальные попытки амплифицировать ДНК с использованием протокола ПЦР, обычно применяемого со свежей ДНК, оказались безуспешными, тогда как амплификация свежих образцов (недавно собранные жуки хранились в этаноле) удалась.
Насекомое, попавшее в древесную смолу, wikipedia.org
Поскольку ДНК извлекалась из полностью измельчённых насекомых вместе с оставшимися после вырезания образцов частями смолы, возникло подозрение, что компоненты смолы могут ингибировать ПЦР. Эту гипотезу проверили, добавляя смолу к контрольным образцам перед экстракцией, — и она не подтвердилась. Тем не менее, в последующих опытах, чтобы избежать любого возможного ингибирования ДНК-полимеразы, в ПЦР-смесь добавляли бычий сывороточный альбумин. Этот белок эффективно связывается с ингибиторами и предотвращает подавление реакции. После этого исследователи проверили ещё два подхода к аплификации специфических фрагментов ДНК: с дополнительной стадией очистки и с увеличением циклов ПЦР до пятидесяти. Оба подхода показали улучшение результата, и специфические фрагменты ДНК были уверенно получены в количестве, достаточном для изучения генного материала организма.
До сих пор неясно, как долго ДНК может сохраняться внутри смолы. Похоже, важную роль в сохранности этих молекул играет вода. Смола создаёт водонепроницаемый барьер, сохраняя влагу в тканях, что тоже может повлиять на стабильность генетического материала. Исследователи планируют применить новый метод к другим насекомым, заключённым в смоле. Они не собираются сразу же приниматься за древний янтарь и будут пробовать извлекать ДНК из всё более старых образцов, начиная с самых свежих.
Источник: Мария Толмачёва, XX2Век
